如何制備感受態(tài)細(xì)胞?

 一、原理：


目前，感受態(tài)細(xì)胞的制備常用冰預(yù)冷的CaCl2處理細(xì)菌的方法制備，即用低滲CaCl2溶液在低溫（0℃）時(shí)處理快速生長(zhǎng)的細(xì)菌，從而獲得感受態(tài)細(xì)菌。此時(shí)細(xì)菌膨脹成球形，外源DNA分子在此條件下易形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附在細(xì)菌表面，通過(guò)熱激作用促進(jìn)細(xì)胞對(duì)DNA的吸收。轉(zhuǎn)化效率可達(dá)106-107轉(zhuǎn)化子/微克DNA。本方法的關(guān)鍵是選用的細(xì)菌必須處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，實(shí)驗(yàn)操作必須在低溫下進(jìn)行。


二、操作：


1.取-70℃冰凍菌種，用劃線法接種細(xì)菌于培養(yǎng)皿，做好標(biāo)記，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜。


2.第二天，從平板上挑取單個(gè)菌落，接種至含有3ml LB培養(yǎng)液的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日取菌液1ml接種至含有100ml LB培養(yǎng)基的500ml燒瓶中，37℃劇烈震蕩培養(yǎng)約2~3小時(shí)（200~300r/min）


3.當(dāng)菌落600nm OD值達(dá)到0.3-0.4時(shí)，將燒瓶取出放置冰上10~15分鐘。在無(wú)菌條件下把菌液倒入50ml離心管中。4℃，4000g離心10分鐘。


4.棄上清，將管倒置于干濾紙上1min，吸干殘留的培養(yǎng)液。加10ml 0.1M的CaCl2到離心管中，振蕩混勻，懸浮菌體，冰浴30分鐘。


5.4℃，4000g離心10分鐘，棄上清，將管倒置于干濾紙上1min，吸干殘留的培養(yǎng)液。加4ml冰預(yù)冷的0.1M的CaCl2,重懸浮菌體。每管0.2ml分裝，至4℃保存?zhèn)溆茫?4-48小時(shí)內(nèi)使用效果較好。如果暫時(shí)不用，可再保存于-70℃的低溫冰箱中。


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