培養(yǎng)細胞的正確“姿勢”

把細胞養(yǎng)好的三個關(guān)鍵要素是：良好的細胞來源，正確的實驗操作，以及合適的培養(yǎng)體系。其中“合適的培養(yǎng)體系"就是要創(chuàng)造適合細胞生長的環(huán)境，給細胞建立一個滿意的“家"。


一、基礎(chǔ)操作流程與關(guān)鍵技術(shù)
1.細胞傳代（貼壁細胞）
時機：當細胞匯合度達80%-90%時進行，過度密集會導(dǎo)致接觸抑制（如成纖維細胞）。
步驟：吸棄原培養(yǎng)基→PBS潤洗（去除殘留血清）→加入胰酶消化（時間因細胞類型而異，通常1-5分鐘）→加入含血清培養(yǎng)基終止消化→輕柔吹打形成單細胞懸液→按比例分裝至新培養(yǎng)瓶。
注意事項：Raw264.7等敏感細胞需控制密度（70%-80%），傳代比例建議1:4，避免過度消化導(dǎo)致細胞損傷。
2.懸浮細胞培養(yǎng)
無需消化，直接離心收集細胞后重懸分裝。需定期監(jiān)測細胞密度和活率，避免聚集。
3.凍存與復(fù)蘇
凍存液：常用10%DMSO+90%胎牛血清，程序降溫后液氮保存。
復(fù)蘇：快速解凍后立即轉(zhuǎn)移至含培養(yǎng)基的離心管，離心去除DMSO，減少毒性。




二、細胞培養(yǎng)基本條件

1.合適的細胞培養(yǎng)基
合適的細胞培養(yǎng)基是體外細胞生長增殖的最重要的條件之一，培養(yǎng)基不僅提供細胞營養(yǎng)和促使細胞生長增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，而且還提供培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。
2.優(yōu)質(zhì)血清
目前，大多數(shù)合成培養(yǎng)基都需要添加血清。血清是細胞培養(yǎng)液中最重要的成分之一，含有細胞生長所需的多種生長因子及其它營養(yǎng)成分。
3.無菌無毒細胞培養(yǎng)環(huán)境
無菌無毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件。在體外培養(yǎng)的細胞由于缺乏對微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染，或者自身代謝物質(zhì)積累，可導(dǎo)致細胞中毒死亡。因此，在體外培養(yǎng)細胞時，必須保持細胞生存環(huán)境無菌無毒，及時清除細胞代謝產(chǎn)物。
4.恒定的細胞生長溫度
維持培養(yǎng)細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。
5.合適的氣體環(huán)境
氣體是哺乳動物細胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。
6.細胞培養(yǎng)溫度
維持培養(yǎng)細胞旺盛生長，必須有恒定而適宜的溫度。不同種類的細胞對培養(yǎng)溫度要求也不同。人體細胞培養(yǎng)的標準溫度為36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。




三、細胞狀態(tài)判斷與問題解決

1.形態(tài)觀察
健康貼壁細胞：邊緣清晰，貼壁均勻（如HEK293呈多邊形）。
異常表現(xiàn)：顆粒增多、空泡化、脫落（可能因污染、消化過度或營養(yǎng)不足）。
2.常見問題處理
污染：立即丟棄并消毒環(huán)境。細菌污染表現(xiàn)為培養(yǎng)基渾濁，真菌可見菌絲。
貼壁不良：檢查培養(yǎng)瓶表面處理（如膠原包被）、血清質(zhì)量或消化時間。Raw264.7細胞復(fù)蘇后貼壁差可短暫離心增強附著。
生長緩慢：排查血清批次差異、培養(yǎng)箱CO?濃度（通常5%）或細胞老化（原代細胞代次不宜過高）。




四、長期培養(yǎng)優(yōu)化建議

1.個性化調(diào)整
不同細胞系需求差異大。例如，原代成纖維細胞偏好高血清（15%），而腫瘤細胞可能需特定生長因子。
記錄每代細胞的形態(tài)和生長曲線，建立標準化操作手冊。
2.輔助措施增強細胞活性
營養(yǎng)支持：補充抗氧化劑（維生素C、E）或膠原蛋白（皮膚細胞培養(yǎng)）。
物理刺激：適度振蕩懸浮培養(yǎng)可改善氧氣交換。




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